IDT NGS二代測(cè)序微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI解決方案

--文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、定制化Panel雜交捕獲探針組

北京云肽生物科技代理的IDT NGS二代測(cè)序產(chǎn)品，通過(guò)高質(zhì)量文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、穩(wěn)定的定制化Panel雜交捕獲探針組、對(duì)手動(dòng)或自動(dòng)化工作站的高通量處理支持，成為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究的高效工具。

一、背景介紹

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)是指在DNA復(fù)制時(shí)由于重復(fù)單位的插入或缺失引起的微衛(wèi)星(Microsatellite,Ms)序列長(zhǎng)度改變的現(xiàn)象，常由錯(cuò)配修復(fù)功能(Mismatch repair，MMR)缺陷引起。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MS!現(xiàn)象于1993年在結(jié)直腸癌中shou次發(fā)現(xiàn)。據(jù)MSI被檢測(cè)出的頻率可以分為三類：微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(MS·H)、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定性(MSIHL)、微衛(wèi)星穩(wěn)定(MS·S)。隨著診療水平的進(jìn)步和靶向藥物、免疫治療的出現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用的越來(lái)越廣泛。MSI微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是一種預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物，同也是一個(gè)泛癌種生物標(biāo)志物，在腫瘤的診斷和治療中扮演著重要角色。

隨著高通量測(cè)序平臺(tái)的廣泛使用和二代測(cè)序NGS成本的降低，NGS平臺(tái)目標(biāo)區(qū)域測(cè)序(NGS Panel)或WES全外顯子組測(cè)序逐漸也應(yīng)用于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI的檢測(cè)中。NGS檢測(cè)通量大、靈敏度及持異性高，采用NGS Panel一次性可以檢測(cè)上千個(gè)MSI位點(diǎn)、錯(cuò)配修復(fù)功能MMR基因狀態(tài)及其他分子標(biāo)志物。同時(shí)，基于外周血循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的MSI微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測(cè)，也為腫瘤組織取樣困難或不足的晚期實(shí)體瘤患者M(jìn)SI檢測(cè)提供了新選擇。

二、

1、IDT xGen cfDNA& FFPE DNA 文庫(kù)制備試劑盒

優(yōu)勢(shì)

①提升樣本轉(zhuǎn)化率，達(dá)到更高的文庫(kù)復(fù)雜度；

②結(jié)合UMI糾錯(cuò)處理，實(shí)現(xiàn)低頻突變的檢測(cè);

③為困難樣本量身打造，更大化數(shù)據(jù)輸出。

圖. IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒提供了非常高的轉(zhuǎn)化率和文庫(kù)復(fù)雜度，從而在目標(biāo)區(qū)城獲得更好的覆蓋深度。使用10ng的cDNA標(biāo)準(zhǔn)品并按照IDT提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫(kù)制備，并用限蓋16kb的定制IDT xGen Custom HybPanels.Production 探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行靶向捕獲。捕獲后的文庫(kù)混合起來(lái)并在lIIumina Nextseq550 測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。采用BWA(0.7.15)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并用Picard(2.18.9)進(jìn)行覆蓋深度和復(fù)雜度(評(píng)估單一分子數(shù)，使用參數(shù)為HS文庫(kù)大小)的計(jì)算。

圖. IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒提高對(duì)低頻突變的檢測(cè)靈敏度和特異性。使用25ng的cfDNA標(biāo)準(zhǔn)品按照IDT提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫(kù)制備，標(biāo)準(zhǔn)品中突變基因的頻率(MAF)為0.25%。使用61kb的定制IDT xGen Custom HybPanels-Production探針進(jìn)行文庫(kù)捕獲，在測(cè)序后使用BWA(0.7.15)進(jìn)行比對(duì)并按照IDT xGen cfDNA&FFPE試劑盒分析指南所述進(jìn)行stanrt-stop去重，或者按照combined read families的方法進(jìn)行去重和錯(cuò)誤校正。最后使用VarDict(1.5.8)識(shí)別變異。PPV=陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，是衡量突變檢出準(zhǔn)確度的指標(biāo)。

2、IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針庫(kù)

IDT xGen Custom HvbPanels·Production 探針是帶有5'端生物素標(biāo)記的DNA探針，每一條探針均經(jīng)過(guò)單獨(dú)合成、單獨(dú)質(zhì)檢，可用于NGS二代測(cè)序中對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行富集。實(shí)驗(yàn)證明，與通過(guò)微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針實(shí)現(xiàn)的捕獲均一性更高，GC偏好性更少，能夠以更少的測(cè)序次數(shù)獲得更佳的測(cè)序深度。IDT xGen Custom Hy b Panels·Production 探針庫(kù)可用模塊化的方式進(jìn)行制備和使用，既可以獨(dú)立使用，也可以通過(guò)spike-in panel的形式與現(xiàn)有的探針庫(kù)結(jié)合使用，具有非常高的靈活性，是品質(zhì)穩(wěn)定、性能優(yōu)異的捕獲探針選擇。

優(yōu)勢(shì)

①單獨(dú)合成、單獨(dú)質(zhì)控的探針，實(shí)現(xiàn)高效均一的目標(biāo)富集;

②模塊化設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的定制和簡(jiǎn)單輕松的目標(biāo)靶點(diǎn)擴(kuò)充;

圖3.使用IDT的探針庫(kù)實(shí)現(xiàn)高度均一的目標(biāo)區(qū)域覆蓋。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA(Coriell)構(gòu)建文庫(kù)，使用lDT xGen Custom Hyo Panels-Production 探針庫(kù)進(jìn)行捕獲反應(yīng)(目標(biāo)區(qū)城為88kb)。富集后的文庫(kù)在lllumina Nextseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)600Kreads進(jìn)行生信分析。結(jié)果顯示，(A)單次測(cè)序的覆蓋均一度較高;(B)同一個(gè)探針庫(kù)的兩個(gè)不同批次，顯示出較高的一致性。

三、成功案例

研究人員使用了IDT xGen Exome Hyb Panel2 以及定制化的IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針庫(kù)(包含150個(gè)癌癥相關(guān)基因)，進(jìn)行了基于血漿樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定MS!檢測(cè)的技術(shù)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證。這是國(guó)內(nèi)通過(guò)臨床療效驗(yàn)證的bMSI檢測(cè)，該研究同時(shí)也對(duì)中國(guó)18個(gè)癌種5000+例真實(shí)大樣本進(jìn)行了MSI微衛(wèi)星不穩(wěn)定的檢測(cè)以及數(shù)據(jù)的總結(jié)。

該研究對(duì)經(jīng)PCR-MSI檢測(cè)確認(rèn)的40例tMSI-H和209例tMSS晚期胃腸腫瘤患者的外周血進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證。該bMSI算法篩出33例tMSI-H患者和201例tMSS患者，與“金標(biāo)準(zhǔn)"組織PCR對(duì)照準(zhǔn)確性達(dá)到94%(靈敏度:82.5%，特異性:96.2%)。

表.通過(guò)二代測(cè)序的方法檢測(cè)血液微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(bMSI)與組織PCR檢測(cè)MSI(tMSI)時(shí)結(jié)果的一致性。

IDT為NGS靶向捕獲實(shí)驗(yàn)提供端到端的產(chǎn)品覆蓋，并在精準(zhǔn)性、經(jīng)濟(jì)性和穩(wěn)定性這三個(gè)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

①精確性:IDT埃豐富的UMI接頭選擇，結(jié)合以IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒為代表的新穎的建庫(kù)方法，可大大提高樣本轉(zhuǎn)化率和檢測(cè)靈敏度;高質(zhì)量的探針合成為高效檢測(cè)體細(xì)胞突變和甲基化水平打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，助力ctDNA的多維度研究。

②經(jīng)濟(jì)性:IDT xGen Custom HybPanels·Accel 探針庫(kù)進(jìn)一步降低使用門(mén)檻，加快探針交付速度，讓新項(xiàng)目快人一步。

③穩(wěn)定性:超過(guò)30年的寡核苷酸合成經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合獨(dú)特的化學(xué)合成工藝和嚴(yán)格的質(zhì)控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針組的表現(xiàn)穩(wěn)定。

四、IDT微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI相關(guān)產(chǎn)品